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发布时间:2020-06-02

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先锋影音资源新资源网-台北故宫紫砂风潮特展金生水,水生木,木生火,火生土专利名称::龙葵提取物、其制备方法及其药物用途的制作方法技术领域::本发明涉及植物龙葵提取物,其制备方法,和作为活性成分制备预防和治疗肿瘤、糖尿病、哮喘病、冠心病等疾病的药物的应用。背景技术::龙葵&/"/"附^^";丄.是一年生茄属草本植物,在国内大部分省区均有生长。全草供药用,性寒,味苦辛微甘,有小毒,归肺、膀胱经。能散瘀消肿,清热解毒。对金色葡萄球菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、变形杆菌、大肠杆菌、绿浓杆菌、猪霍乱杆菌均有较强的抑菌作用,有抑制癌细胞以及泌尿系统感染和白带等功效,常用治疗痈肿,肿瘤,痢疾等,民间用于治疗糖尿病疗效显著。此外龙葵还有一定的食疗作用,因此具有很好的药用价值。植物体内富含甾体类生物碱,如澳洲茄碱(solasonine)、澳洲茄边碱(solamargine)、澳洲茄明碱(solasodamine)、£-龙葵碱(e-solanigrine)、S-龙葵碱(5-solanigrine)、龙葵定碱(solanigridine)、刺茄碱solasurine等,这些甾体类生物碱均以苷的形式存在于龙葵茎、叶、根、果,苷元是澳洲茄胺(solasodine)。formulaseeoriginaldocumentpage5澳洲茄碱]formulaseeoriginaldocumentpage5茄边碱formulaseeoriginaldocumentpage5刺茄碱solasurine澳洲茄碱和茄边碱是龙葵中主要的两个生物碱成分,在体外试验中,两个化合物均表现出对细胞膜脂的破坏性,两者表现出协同效应,茄边碱的破坏性更强,其中的鼠李糖可能在引导糖苷生物碱与细胞的结合中起了重要作用;一些对茄边碱的研究表明,茄边碱能够调节肿瘤坏死因子受体的表达从而引起癌细胞凋亡,2位的鼠李糖可能在触发细胞凋亡中起决定性作用。其它糖苷生物碱也表现出近似的生理活性。因此,摸索出合适的工艺,从龙葵中提取出糖苷总生物碱部位,进行药效研究,可以作为抗肿瘤新药研究的一个方向。对龙葵粗提物的预防治疗糖尿病、哮喘病和冠心病等活性的研究也是目前国外的关注点,但目前还没有研究确切地表明是粗提物中哪些化学成分在起作用。中国专利授权公告号CN1329038C公开的茄属植物的水溶性萃取物、其制备方法及其药学组合物,其中水溶性萃取物是基本上是由60%-90%的澳洲茄碱及茄边碱所构成。目前使用的龙葵提取方法成本较高,有效成分含量较低,杂质较多,且制备过程中产生的污染较大。经提取后得到的产物有效成分的含量限制了其在药学组合物中的使用,尚不能满足高效药学组合物的需要。发明内容本发明的目的第一方面是提供了一种龙葵提取物。本发明的目的第二方面是提供上述龙葵提取物的制备方法。本发明的目的第三方面是提供上述龙葵提取物在药物中的应用。作为本发明第一方面的龙葵提取物,包含澳洲茄碱和茄边碱,还包含刺茄碱,其中澳洲茄碱、茄边碱和刺茄碱三者的总含量为80wt%99wt%。澳洲茄碱含量为30wt°/。50wt%,茄边碱含量为10wt%30wt%,剌茄碱含量为30wt%50wt%。作为本发明第二方面的龙葵提取物的制备方法,包括以下步骤-(1)龙葵全草与/或果实,加乙醇提取,收集提取液A;(2)回收提取液中的乙醇至无醇味,得浓縮液B;(3)浓縮液B用阳离子交换树脂吸附,依次用水、乙醇和含碱乙醇进行洗脱,收集含碱乙醇洗脱部分C;(4)含碱乙醇洗脱部分C,回收乙醇得浓缩液D;(5)浓縮液D离心分离,弃上清液,得沉淀物E;(6)沉淀物E用水洗涤至近白色且上清液pH值小于9,沉淀干燥后即得龙葵提取物。在上述步骤(1)中,乙醇的用量每次为生药量的28倍体积;乙醇的重量百分比浓度为50%95%。优选为乙醇的用量每次为生药量的5倍体积;乙醇的重量百分比浓度为90%。在上述步骤(1)中,采用回流或超声方式提取,提取次数为25次,每次13小时。优选为采用回流方式提取,提取次数为3次,每次1.5小时。当生药材为龙葵全草,在上述步骤(2)中,增加一个对浓縮液B用石油醚萃取脱脂的步骤。优选为对浓縮液B用等体积石油醚萃取3次脱脂。在上述步骤(3)中,阳离子交换树脂的用量为生药量的0.55倍体积。优选为生药量的1倍体积。所述阳离子交换树脂的功能基为磺酸基、甲基磺酸基、磷酸基、羧基和酚羟基之中的一种。优选为磺酸基。在上述步骤G)中,优选的洗脱方法为依次用水洗树脂至流出液近无色,110倍树脂体积的重量百分比浓度为30%90%的乙醇洗脱,0.510倍树脂体积的含碱乙醇洗脱。更优选的洗脱方法为依次用水洗树脂至流出液近无色,12倍树脂体积的重量百分比浓度为30%60%的乙醇洗脱,15倍树脂体积的重量百分比浓度为90%的乙醇洗脱,15倍树脂体积的含碱乙醇洗脱。最优选的洗脱方式为依次用水洗树脂至流出液近无色,1倍树脂体积的重量百分比浓度为40%的乙醇洗脱,2倍树脂体积的重量百分比浓度为卯%的乙醇洗脱,3倍树脂体积的含碱乙醇洗脱。在上述步骤(3)中,所述含碱乙醇是重量百分比浓度为5095%乙醇与碱的混合溶液,其中碱为氨水、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠以及其它工业生产常用的碱之中的一种。优选的含碱乙醇是重量百分比浓度为90%乙醇与重量百分比浓度为25%氨水按体积比10:1混合的溶液。在上述步骤(6)中,如果沉淀物E颜色较深,增加一用丙酮洗涤沉淀至近白色的步骤。在上述步骤(3)中,所述的阳离子交换树脂可以再生,其再生的方法是用2%氢氧化钠水溶液加热浸泡树脂;装柱,用2%的氢氧化钠水溶液800ml洗脱;用水洗至流出液呈中性;用1N盐酸洗树脂至流出液pH值为2;用去离子水洗树脂至流出液pH值为6,即可投入重复使用。根据本发明制备方法获得的龙葵提取物中澳洲茄碱、茄边碱和刺茄碱三者的总含量为80wt%99wt%,澳洲茄碱含量为30wt%50wt%,茄边碱含量为10wt%30wt%,刺茄碱含量为30wt%50wt%。作为本发明第三方面的上述龙葵提取物的药物用途是以所述的龙葵提取物中的澳洲茄碱、茄边碱和刺茄碱作为活性成分,加入药学上可接受的辅料,制成的任何一种剂型的药物。优选的剂型为注射剂。作为本发明第三方面的龙葵提取物在作为活性成分在制备预防与治疗肿瘤、糖尿病、哮喘病、心脏病等疾病的药物中的应用。上述龙葵提取物作为活性成分的具体药物用途如下,但不限于下述药物用途1、以龙葵提取物作为活性成分可以在制备预防和治疗肿瘤药物中应用。2、以龙葵提取物作为活性成分可以在制备预防和治疗糖尿病药物中应用。3、以龙葵提取物作为活性成分可以在制备预防和治疗哮喘病药物中应用。4、以龙葵提取物作为活性成分可以在制备预防和治疗冠心病药物中应用。本发明的龙葵提取物含有活性成分澳洲茄碱、茄边碱和刺茄碱,其在预防与治疗肿瘤、糖尿病、哮喘病、冠心病等疾病方面有一定疗效。本发明的制备方法与现有技术相比,该方法工艺先进,大生产实用性强,成本相对较低。有机溶剂主要为乙醇,使用后的酸碱均经处理后排放,环境污染小。所得提取物杂质少,有效成分含量高。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明,但不以任何方式限制本发明。实施例1龙葵提取物的制备(1)龙葵全草400g,力B90%乙醇2000ml,回流提取3次,每次1.5小时;(2)提取液回收乙醇至无醇味,得浓縮液约300ml,石油醚萃取3次,每次用量为300ml;(3)浓縮液用400ml处理成H+型的HD-8强酸型阳离子交换树脂(上海华震科技有限公司)装柱吸附,依次用水洗脱至流出液近无色,40%乙醇400ml洗脱,90%乙醇800ml洗脱,含氨水乙醇(90%乙醇25°/。氨水为10:1)1200ml洗脱;(4)收集含氨水乙醇洗脱部分,回收乙醇;(5)浓縮液5000rpm离心IO分钟,弃上清液;(6)少量水洗涤沉淀,5000rpm离心IO分钟,如此用水洗涤2次,再用少量丙酮洗涤一次,沉淀减压干燥后即得龙葵提取物0.17g,收率0.04%。其中树脂再生过程如下用2W氢氧化钠水溶液800ml加热浸泡树脂;装柱,用2%的氢氧化钠水溶液800ml洗脱;用水洗至流出液呈中性;用1N盐酸洗树脂至流出液pH值为2;用去离子水洗树脂至流出液pH值为6,即可投入重复使用。实施例2龙葵提取物的制备(1)龙葵果实1000g,加卯o/o乙醇5000ml,回流提取3次,每次1.5小时;(2)提取液回收乙醇至无醇味,得浓縮液约800ml;(3)浓縮液用1000ml处理成H+型的HD-8强酸型阳离子交换树脂(上海华震科技有限公司)装柱吸附,依次用水洗脱至流出液近无色,40%乙醇1000ml洗脱,90%乙醇2000ml洗脱,含氨水乙醇(卯%乙醇25%氨水为10:1)3000ml洗脱;(4)收集含氨水乙醇洗脱部分,回收乙醇;(5)浓縮液5000rpm离心IO分钟,弃上清液;(6)少量水洗涤沉淀,5000rpm离心IO分钟,如此用水洗涤2次,再用少量丙酮洗涤一次,沉淀减压干燥后即得龙葵提取物1.5g,收率0.15%。其中树脂再生过程如下用2%氢氧化钠水溶液2000ml加热浸泡树脂;装柱,用2%的氢氧化钠水溶液2000ml洗脱;用水洗至流出液呈中性;用lN盐酸洗树脂至流出液pH值为2;用去离子水洗树脂至流出液pH值为6,即可投入重复使用。实施例3龙葵提取物的制备(1)龙葵全草400g,加卯。/。乙醇2000ml,超声提取3次,每次1.5小时;(2)提取液回收乙醇至无醇味,得浓縮液约300ml,石油醚萃取3次,每次用量为300ml;(3)浓縮液用400ml处理成H+型的HD-8强酸型阳离子交换树脂(上海华震科技有限公司)装柱吸附,依次用水洗脱至流出液近无色,40%乙醇400ml洗脱,卯%乙醇800ml洗脱,含0.1%氢氧化钠的80%乙醇1200ml洗脱;(4)收集含氢氧化钠乙醇洗脱部分,回收乙醇;(5)浓縮液5000rpm离心IO分钟,弃上清液;(6)少量水洗涤沉淀,5000rpm离心IO分钟。如此用水洗涤4次后,上清液pH值约为8。沉淀干燥后即得龙葵提取物0.13g,收率0.03%。其中树脂再生过程如下用2。/。氢氧化钠水溶液800ml加热浸泡树脂;装柱,用2°/。的氢氧化钠水溶液800ml洗脱;用水洗至流出液呈中性;用1N盐酸洗树脂至流出液pH值为2;用去离子水洗树脂至流出液pH值为6,即可投入重复使用。实施例4龙葵提取物中生物碱的鉴别测定(液质联用法)实验仪器液质联用仪,Agilent1200LC/MSD/VL蒸发光散射检测器,SoftA300A迪马C18钻石柱,250X4.6mmHPLC条件甲醇:0.2%乙酸,梯度0min,5:95;10min,5:95;15min,90:10;25min,100:0。流速0.8ml/min,柱温35。C。蒸发光散射检测器检测条件DT=70'C,SC=35°C,GAS:50psi实验方法和结果取龙葵提取物10mg,精密称定,置25ml量瓶中,少量甲醇溶解,甲醇稀释至刻度,0.45pm微孔滤膜过滤,l(Hil进样。保留时间在1620分钟之间的一组峰为糖苷生物碱,峰面积之和占总峰面积的85%。HPLC-MS检测出分子离子峰17.5min,884(澳洲茄碱,M+l);17.8,868(茄边碱,M+l);18.2,722(剌茄碱,M+l)。实施例5龙葵提取物中生物碱含量的测定(薄层扫描法)实验仪器岛津CS-9310型双波长薄层扫描仪TLC条件高效硅胶G板10cmX20cm;展开剂为正丁醇:氨水(4:1)上层液;碘化铋钾显色;AS=468nm扫描。实验方法和结果取龙葵提取物10.05mg,精密称定,置5ml量瓶中,少量甲醇溶解,甲醇稀释至刻度,摇匀,取5nl点样,展开,显色,扫描,澳洲茄碱、茄边碱和刺茄碱三个点的面积百分比为40.5%、25.4%和34.1%。实施例6龙葵提取物注射剂的制备取龙葵提取物2000mg,加注射用水900ml,1,2-丙二醇50ml,氯化钠9g,用0.1N的盐酸调pH值至4.0,加注射用水至1000ml,用0.2pm微孔滤膜过滤,灌封,湿热灭菌,得龙葵提取物注射剂。实施例7龙葵提取物灌胃给药对小鼠肝癌H22影响的实验研究选取18~20g雌性C57BL/6小鼠,取生长良好的小鼠肝癌H22腹水,用生理盐水稀释成12xl(^个/ml浓度的细胞悬液,每只小鼠右腋皮下接种0.2ml,随机分组,每组动物数10只,对照组15只,设空白对照组(相应溶剂,25ml/kg,igx7)注射用环磷酰胺(30mg/kg,ipx7)龙葵提取物(50mg/kg,igx7)龙葵提取物(100mg/kg,igx7)龙葵提取物(200mg/kg,igx7)龙葵提取物用数滴吐温-80助溶后用0.5%CMC配成混悬液,注射用环磷酰胺用生理盐水配制成所需浓度。接种后次日起给药,给药体积为0.5ml/20g体重,连续经口灌胃7天。接种后10日脱颈处死动物,解剖取瘤块,称瘤重,计算抑瘤率。试验结果见表l,龙葵提取物在50、100、200mg/kg的水平上经口灌胃给药时可以明显降低小鼠肝癌H22组织水平。给药7天后,各给药组与对照组相比,瘤重有显著差异(PO.Ol)。表1.龙葵提取物灌胃给药对小鼠肝癌H22的抑瘤作用

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实施例8龙葵提取物灌胃给药对小鼠Lewis肺癌影响的实验研究选取18~20g雌性C57BL/6小鼠,取生长良好的小鼠Lewis肺癌瘤块,用生理盐水匀浆法制备成12xI(T个/ml浓度的细胞悬液,每只小鼠右腋皮下接种0.2ml,随机分组,各组动物数6只,对照组12只,设空白对照组(相应溶剂,25ml/kg)注射用环磷酰胺(30mg/kg,ipx7)龙葵提取物(50mg/kg,igx10)龙葵提取物(100mg/kg,igx10)龙葵提取物(200mg/kg,igx10)龙葵提取物用数滴吐温-80助溶后用0.5。/。CMC配成混悬液,注射用环磷酰胺用生理盐水配制成所需浓度。接种次日起给药,给药体积为0.5ml/20g体重,连续经口灌胃10天。接种后14日脱颈处死动物,解剖取瘤块,称瘤重,计算抑瘤率。试验结果见表2,龙葵提取物在50、100、200mg/kg的水平上经口灌胃给药时可以明显降低小鼠Lewis肺癌组织水平。给药10天后,各给药组与对照组相比,瘤重有显著差异(PO.Ol)。表2.龙葵提取物灌胃给药对小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用
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与对照组比较*P<0.05,**P<0.01。实施例9龙葵提取物皮下、腹腔给药对小鼠肝癌H22影响的实验研究选取1820g雌性C57BL/6小鼠,取生长良好的小鼠肝癌H22腹水,用生理盐水匀浆法制备成12xl(^个/ml浓度的细胞悬液,每只小鼠右腋皮下接种0.2ml,随机分组,各组动物数10只,对照组15只,设空白对照组(相应溶剂,25ml/kg)注射用环磷酰胺(30mg/kg,ipx7)龙葵提取物(40mg/kg,scx10)龙葵提取物(40mg/kg,ipx10)龙葵提取物用数滴吐温-80助溶后用0.5%CMC配成混悬液,注射用环磷酰胺用生理盐水配制成所需浓度。接种次日起给药,给药体积为0.5ml/20g体重,连续皮下、腹腔给药7天。接种后10日脱颈处死动物,解剖取瘤块。

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